糖蛋白的糖基化位點和寡糖的異質(zhì)性的快速測定

摘要: 采用鏈霉蛋白酶進行酶解可以避免傳統(tǒng)胰蛋白酶酶解法的一些不足。此外，與GlycoX程序結(jié)合后，該方法具有適用于高通量大規(guī)模的糖蛋白質(zhì)組學研究的潛力。

        糖基化是原核蛋白中最常見的翻譯后修飾形式之一^[1]。糖基化位點和寡糖異質(zhì)性的測定對于理解糖蛋白特殊的生物學作用是至關重要的。據(jù)估計至少有50%的人源蛋白經(jīng)過糖基化修飾^[2]。最主要的兩類糖基化修飾方式是N端糖基化和O端糖基化。N端多糖經(jīng)氨基連接在天冬酰胺殘基上，具有特定序列N-X-（S或者T）。這里X可以是除脯氨酸外的任意一種氨基酸。N端連接的聚糖具有由兩個N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）和三個甘露糖（Man）殘基形成的單核。O端的聚糖連接到絲氨酸或蘇氨酸上，但沒有單一共同的單核或特定的蛋白序列。

        由于糖蛋白的高度復雜性，糖基化位點分析具有極大的挑戰(zhàn)性。最近有一些關于糖基化位點分析的報道^[3-11]。常用方法包括以下步驟（見圖1a）：專一蛋白酶的酶解（通常是胰蛋白酶）、糖肽的富集（通常采用液相色譜或親和色譜）和糖肽的質(zhì)譜分析^[7-11]。有時也可通過糖肽的去糖基化獲得丟失的聚糖信息^[7,11]。然而許多糖蛋白不易被胰蛋白酶酶解^[12,13]。此外，由于糖基化會造成胰蛋白酶酶切位點的丟失，因此酶解產(chǎn)生的糖肽太大而不適于質(zhì)譜分析^[9]�；�于上述原因，目前獲得的糖基化信息通常是不完全的。

        作者所在的實驗室中發(fā)展了一種獨特的能夠同時測定糖蛋白中N端糖基化位點和寡糖異質(zhì)性的方法（見圖 1b）^[4]。利用該方法，糖蛋白被非專一性的蛋白酶酶解。通過采用高活性的蛋白酶混合物，即鏈霉蛋白酶，形成大量較短的糖肽（含2~8個殘基）。糖蛋白的非糖基化部分被酶解成氨基酸和二肽，而糖基化部分被寡糖保護從而抑制了蛋白酶的活性。采用裝有多孔石墨化碳（PGC）的固相萃�。⊿PE）柱可以很容易地將產(chǎn)生的糖肽與氨基酸和鹽分離。同時，糖蛋白用 N-糖酰胺酶F(PNGase F)處理。PNGase F能夠從糖蛋白中專一地切割N端糖基。然而該操作僅對于具有幾個糖基化位點的較大糖蛋白是必要的,較小的糖蛋白不需要單獨地測定寡糖的組成。在任何情況下釋放的聚糖可采用裝有PGC的SPE柱純化。純化的糖肽和聚糖可采用基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜（MALDI-MS）和高精度的傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FT-ICR-MS）進行分析。采用后者可以完成對任一糖基化位點的確認和聚糖異質(zhì)性分析。

1 鏈霉蛋白酶酶解

        先將約10 nmol的糖蛋白溶解在0.1 mol/L Tris 緩沖液（pH 7.5）中，再用約10個單位的鏈霉蛋白酶處理。上述溶液在37 ℃放置36~48 h。同時，采用PNGase F在37 ℃ 條件下酶解糖蛋白12 h，釋放 N端連接的聚糖。采用裝有PGC的SPE柱純化由非專一蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的糖肽和由PNGase F釋放的寡糖。將裝有PGC的SPE柱依次用水和含有0.05％（v/v）三氟乙酸（TFA）的80％乙腈（ACN）/水（v/v）沖洗。再將酶解的糖蛋白或寡糖溶液上樣到PGC柱上。隨后用去離子水以1 mL/min的流速沖洗，去除鹽和緩沖液。最后分別用含有0.05％TFA的10％ACN、20％ACN和40％ACN洗脫糖肽和多糖。在進行MALDI分析前，將每一次洗脫液分別收集并真空濃縮。

2 質(zhì)譜

        質(zhì)譜采用配備7.0 特斯拉磁場和用于離子化的脈沖摻釹釔鋁石榴石（Nd：YAG）激光（355 nm）的外源HiResMALDI（IonSpec Corp., Irvine, CA）。采用溶于5 mg/100 μL乙醇的2,5-二羥基安息香酸（DHB）作基體；采用飽和的氯化鈉（或者氯化鉀）-甲醇溶液作摻雜劑，以產(chǎn)生糖肽和寡糖的堿金屬相關的準分子離子。將1 μL糖肽/寡糖溶液和1 μL的基體溶液依次滴加到MALDI靶體。樣品在空氣流中干燥后進行質(zhì)譜分析。示波器 | 電阻計 | 可燃氣體檢測儀 | 粒子計數(shù)器 | 傳送器 | 鉤表 | PH計 | 萬能鉗 | 溫濕度儀 | 溶氧計 | 試驗機 | 溫度記錄儀 | 鹽度計 

3 糖基化位點的表征

        為了驗證該實驗策略，對一個具有單一糖基化位點（⁶⁰N）和已知寡糖結(jié)構的模式糖蛋白核糖核酸酶B進行了表征^[14]。由鏈霉蛋白酶酶解后分離出的糖肽的正離子模式質(zhì)譜圖如圖 2a所示。該譜圖是在沒有經(jīng)過高效液相色譜（HPLC）分離而只采用最簡單的樣品預處理后獲得的。由于被酶解為氨基酸，大的非糖肽碎片并沒有出現(xiàn)。觀察到的大于m/z 1 000的譜峰對應的是糖肽，這是因為寡糖配基的質(zhì)量單位至少為800（GlcNAc2Man3）。在譜圖中出現(xiàn)了兩個糖肽系列（空心和實心的方塊分別代表系列1和系列2），分子質(zhì)量相差162 Da（1個甘露糖殘基）。樣品中添加NaCl可獲得更多的信息。摻雜劑能增強系列1中5個峰的相對強度，這與鈉離子的加成物相關（圖 2a）。另一系列是質(zhì)子化樣品，其強度隨著NaCl的加入而降低。

        為了鑒定圖 2a中的多肽碎片，采用PNGase F將多糖從糖蛋白中釋放出來，并用MALDL-MS進行分析（圖 2b）。圖 2a中觀察到的5個多糖峰代表5個糖肽，其信號分別相應于組成從GlcNAc- 2Man5到 GlcNAc2Man9的高甘露糖寡糖與鈉離子的加成物。相鄰譜峰的質(zhì)量差是162 Da，相當于一個甘露糖殘基。圖 2b中的5個多糖的信號相對強度與圖 2a中5個糖肽的一致。

        通過從糖肽質(zhì)量中減去觀察到的多糖質(zhì)量可以對多肽碎片進行鑒定。例如，圖 2a系列2中的第一個峰（m/z 1 505.456）對應的是帶有多糖GlcNAc-2Man5（m/z 1 257.420）的糖肽。肽段的質(zhì)量可以由觀察到的糖肽質(zhì)量1 504.45 Da（[M+H]⁺減去H⁺）減去觀察到的多糖質(zhì)量1 216.42（[M+Na]⁺ 減去 Na⁺和H₂O）獲得。多肽的質(zhì)量288.12 Da相當于糖基化位點在⁶⁰N的二肽精氨酸-天冬氨酸（RN）（理論質(zhì)量288.15 Da）。理論質(zhì)量與實驗質(zhì)量的差異通常小于20 ppm，因此可以斷定系列2中的糖肽包含帶有從GlcNAc2Man5 到 GlcNAc2Man9的高甘露糖寡糖的二肽RN。系列1中質(zhì)量最小的峰(m/ z 1 371.39)對應著帶有寡糖GlcNAc2-Man5的糖肽（m/z 1 257.42）。132.07 Da的肽段質(zhì)量對應的是天冬氨酸（理論質(zhì)量132.05 Da），因此系列1中的糖肽包含1個單個N端殘基。為了證明可根據(jù)離子的相對豐度進行定量分析，圖 3給出了每個多糖的相對豐度測定結(jié)果。因為這些多糖的結(jié)構、大小和離子化效率相似，因此可以計算出糖蛋白中寡糖的相對豐度^[15]。

        根據(jù)上述策略，可以確定從簡單到復雜的糖蛋白中的專一糖基化位點，并獲得內(nèi)在的位點異質(zhì)性信息。通過對模式蛋白如核糖核酸酶B和雞卵清蛋白（含有兩個潛在的位點，其中一個由計算得出）的分析，驗證了結(jié)果的準確性。對于更復雜的含有未知糖基化位點的糖蛋白如來源于有爪蟾蜍（XL）和非洲蟾蜍（X）卵子的腦皮層顆粒凝集素（CGL1和CGL2）也進行了研究。分布在XL CGL2中N端糖基化位點上的多糖如圖 4所示。采用該策略，也可對更復雜的糖蛋白如包括了7個潛在的未知糖基化位點的葡萄糖氧化酶進行分析。

4 GlycoX程序

        作者的實驗室還開發(fā)了一個新的用來幫助分析實驗數(shù)據(jù)的電腦程序??GlycoX^[16]。這個軟件是在MATLAB基礎上發(fā)展的，需要把質(zhì)譜圖以ASCII文檔形式輸入。它是利用已知蛋白序列的精確的糖肽和多糖質(zhì)量來判斷N端和O端連接的糖基化位點和微小的異質(zhì)性。該程序能自動分析由非專一性或者低專一性蛋白酶水解（例如：鏈霉蛋白酶E或蛋白酶K）得到的糖肽質(zhì)譜圖。它具有三個主要功能：糖基化位點的搜索功能，用來判斷糖蛋白的糖基化位點以及寡糖的異質(zhì)性；寡糖計算功能，用來判斷寡糖的組成是N端連接、O端連接還是經(jīng)化學修飾的寡糖；自動同位素過濾功能，用來從糖肽、肽和多糖質(zhì)譜圖中選擇單一的同位素峰。GlycoX流程圖如圖 5所示。

        將質(zhì)量強度（M/I）表（以ASCII格式保存）和從SWISS-PROT/TrEMBL數(shù)據(jù)庫（FASTA格式，以文本文件保存）中獲得的對應的糖蛋白的序列輸入到GlycoX程序中。為了確定糖基化位點和對應的多糖，對經(jīng)同位素過濾的質(zhì)量進行分析，從而確定它們和哪種多糖和肽段質(zhì)量對應。通過比較從單肽到用戶定義的最大長度的肽段序列可以判斷肽段的組成。利用該程序，也可以搜索匹配的分析量來判斷多糖的質(zhì)量。此外，也可以利用光譜來確認多糖的質(zhì)量。對復雜的糖基化位點的分析，推薦采用多糖譜圖對比的方法。

        采用鏈霉蛋白酶酶解可以避免常用的胰蛋白酶酶解的一些缺點。此外，GlycoX程序具有適用于高通量大規(guī)模的糖蛋白質(zhì)組學研究的潛力。